有用于微创光遗传学改进的光灵敏度Channelrhodopsins

发布者1188金宝搏亚洲 在2020年11月3日上午9点15分零零秒


光遗传学是一种神经科学方法,让你火神经元与光开188棋牌游戏关轻弹。神经元通常不被说服火当光照射在他们,但光门控离子通道如channelrhodopsins(CHRS)的表达使它们光响应。当光在兴奋性通道蛋白表达神经元照,所述channelrhodopsins通过开口,并允许离子的流入,其产生动作电位神经元(图1)作出响应。这种光致激发可以发生在组织培养皿,但也有可能发生在老鼠的大脑内的实时性。

但大脑是一个棘手的器官来访问,这常常迫使科学家们使用侵入性的措施来执行体内光遗传学实验。AAV的颅内注射常用于提供channelrhodopsins到大脑。这种递送途径集中大量channelrhodopsins在脑中,这是必要的,因为当前channelrhodopsins工具具有低电导率,而且界限紫红质通道激活的脑组织的小体积(约1毫米的一个区域3)。当前channelrhodopsins还需要激活高强度的光,需要的光纤电缆植入到脑。

紫红质通道的图形与蓝光激活。如果不亮,通道视紫红是无效的,没有离子流入和神经元不火。蓝色光时,通道视紫红打开并允许离子的流入神经元。这导致神经元放电。
图1:在没有蓝光时,紫红质通道保持无效和神经元不火。随着蓝光,离子流入神经元,并导致火灾。创建了BioRender.com。

为了使通道蛋白基光遗传学微创,弗朗西斯·阿诺德的实验室和维维亚娜·格雷迪纳鲁的实验室使用机器学习来设计新channelrhodopsins是多个光敏和具有增强的电导相比,目前的channelrhodopsins。他们的新channelrhodopsins,叫ChRgers,使大脑更容易一些与光遗传学的访问。

工程channelrhodopsins的挑战

有工程channelrhodopsins有改进的光电流特性三大挑战:

  1. 的序列和确定表达膜和跨膜蛋白的质膜定位结构,如视紫红质,是高度受限的和了解甚少。
  2. 很难用工程高通量蛋白质的方法来设计新channelrhodopsins,如定向进化,因为channelrhodopsins通常与低通量方法如膜片钳电生理学,这是用来测量在活细胞中离子通道的电流的技术评估。
  3. 一个通道视紫红的多个属性,诸如细胞定位,动力学,和光谱性质,必须以生成一个通道视紫红这是成功的同时优化体内

使用机器学习克服紫红质通道设计挑战

为了克服这些挑战,阿诺德和Gradinaru实验室研制出机器学习模型,帮助他们构建具有所需特性的“设计师” channelrhodopsins。该模型训练以预测如果一个通道视紫红序列将导致功能性通道视紫红,以及预测紫红质通道的光电流强度,波长灵敏度,和离动力学。

然后,该模型用于预测哪些channelrhodopsins从〜120000预测通道视紫红序列的文库将具有最适合于微创光遗传学实验光电流特性。此库中的序列使用设计关于亲本channelrhodopsins结构信息来创建重组通道视紫红序列。从库中的模型首先被去除的序列预测为是无功能的,减小库1161组的序列。选择这些剩余序列的三十用于与膜片钳电生理学表征。所有的30个是有功能的和它们的测量的光电流的振幅,波长灵敏度,和离动力学与模型的预测相关联。

三个表演者,命名ChRger1,ChRger2,和ChRger3,然后通过在培养的神经元和收集小鼠的大脑切片表达进一步的特征在于以下表达ChRger的AAV的颅内注射。在两个实验中,表达ChRgers神经元以比现有channelrhodopsins CoChR和/或的ChR2(H134R)低的光强度产生光电流更强。

获取微创光遗传学ChRgers!

有全身AAV配对设计channelrhodopsins允许微创光遗传学

虽然ChRgers在组织培养皿中表现出色,并不能保证他们的成功体内。因此,阿诺德和Gradinaru实验室表示小鼠ChRgers,看看他们是否是适合体内微创光遗传学。这两个实验中通过PHP.eB,在静脉注射交付ChRgersAAV衣壳能够对神经系统的广泛转导从而消除了颅内注射的需要。当PHP.eB,ChRgers和的ChR2(H134R)包装都到达大脑,但与直接注射相比单个神经元不表达作为CHRS的多个副本。感染的这种较低的复数(MOI)使得它具有挑战性的ChR2(H134R),以功能,因为它是低conducence需要以激活神经元更高的表达水平。ChRgers,然而,有较高的导电性,所以他们仍然可以以较低的MOI去极化的神经元。

紫红质通道输送通过静脉内注射。一种纤维光缆允许蓝色光到达小鼠脑。
图2:是ChRgers通过静脉内注射递送到小鼠中。一种纤维光缆允许蓝色光到达大脑。创建了BioRender.com。

在第一个实验,ChRger2是非侵入性递送至脑的腹侧被盖区(VTA)中的多巴胺能神经元。由于VTA位于中脑,光纤套管仍然立体定向植入到小鼠的大脑,使得光可以达到的VTA。然后将小鼠通过触发光的突发时,他们戳他们的鼻子到在其笼中的孔,可以激活ChRger2或的ChR2(H134R)允许“自激发”他们的VTA多巴胺能神经元。由于多巴胺是促进奖励动机的行为,如果channelrhodopsins激活多巴胺能神经元的VTA,这应该一个重要的神经递质推动小鼠,以增加自己的鼻子刺探行为。坚挺的鼻梁刺探行为正是与ChRger2表达小鼠中观察到,而的ChR2(H134R)表达的小鼠没有这种自我刺激的反应。这一结果表明,ChRger2更强的光电流特性使其更适合于全身给药与PHP.eB相对于现有的ChR2(H134R)。

在第二个实验,ChRger2被交付,并用非侵入性方法的神经元在右次级运动皮层(M2)激活。因为M2位于脑的表面上,以将光传送到通道蛋白表达神经元,实验室可以薄小鼠的附近的颅骨M2和固定光纤套管到颅骨,留下完整的脑。当光纤灯被打开,接受ChRger2老鼠转向是如果在正确的M2神经元被激活,要的是什么左侧,但收到的ChR2(H134R)小鼠没有转身。当光被关闭在ChRger2处理的小鼠左转向行为停止。

一起这两个实验中确定ChRger2的当与PHP.eB的全身递送配对改进的光灵敏度和更高的光电流特性使得微创基因递送和光遗传学激励。神经元在大脑更深可能仍然需要光纤插管植入,但改变ChRgers的激励,这样他们可以与组织穿透的近红外光将允许非侵入性脑深部光遗传学被激活。

TL; DR

新channelrhodopsins,叫ChRgers,使其更容易和微创大脑中的使用光遗传学。


参考

Bedbrook CN,杨KK,罗宾逊JE,麦基ED,Gradinaru V,阿诺德FH(2019),机器学习,引导紫红质通道工程使微创光遗传学。纳特方法16:1176年至1184年。https://doi.org/10.1038/s41592-019-0583-8

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