CRISPR 101:非同源末端连接

发布者游客的博客在2015年4月16日上午11时45分08秒


这个职位是贡献的大卫·怀亚特和Dale拉姆斯登,UNC教堂山分校。

在基因组工程中使用CRISPR/Cas系统的一个优点是Cas9可以很容易地编程在任何用户选择的基因组中制造DNA双链断裂(DSB)。在最初的切割之后,接下来的步骤包括修复DNA双链断裂染色体。重要的是要知道,细胞具有两个主要的修复途径是非常重要的- - - - - -非同源末端连接(NHEJ)和同源定向修复(HDR)——以及这些途径是如何工作的,因为这可能与计划你的实验有关。这个博客之前认为是HDR途径;下面我们将讨论NHEJ,以及它如何影响基因组中cas9介导的DSBs的发生。

点击下载Addgene的CRISPR 101电子书

异源端加入

与HDR不同,NHEJ在整个细胞周期中都是活跃的,并且有更高的修复能力,因为它不需要修复模板(姐妹染色单体或同源物)或大量的DNA合成。NHEJ还能在数十分钟内完成大多数类型的破损修复- - - - - -一个数量级比HDR更快。NHEJ因此是原理手段,通过该CRISPR / Cas9引入符修复。

以下因素都需要NHEJ修复不管最终的结构,决定了通道的主要事件:

  1. 断端可以通过装载来识别Ku70 / Ku80异源二聚体
  2. 喾接着充当支架用于激酶的募集(中DNA-PKcs)和一个双亚基DNA连接酶(XRCC4-ligase IV);连同一些辅助因素(PAXX, XLF),该复合物保持在一对DNA末端在一起,形成一个配对末端复杂
  3. 然后,配对的末端复合体将兼容的DNA末端连接在一起,从而修复断裂。

这是该途径的简化、精简版本,没有考虑到DSBs生物来源中常见的需要处理的缺失或受损的核苷酸。处理发生在结扎之前,因为不相容的DNA末端干扰了这一步骤。因此,NHEJ拥有一个巨大的加工因子工具箱,包括聚合酶(Pol)、核酸酶(Artemis)和结构特异性末端清洁酶(Aprataxin, Tdp2),它们的功能是使末端更好的底物进行连接。虽然我们在这里没有描述这些步骤,但DNA末端的处理往往是引入突变的点。

通过NHEJ Cas9引起的断裂的修复

如下所示,nhej介导的cas9产生的突变修复对于在你感兴趣的基因中产生一个空等位基因(“敲除”)是有用的,因为它容易产生indel错误。NHEJ修复过程中产生的Indel错误通常很小(1-10 bp),但非常不均匀。因此,产生移码突变的可能性约为三分之二。重要的是,当受到侧翼序列身份(“微同源性”)的限制时,缺失可以减少异质性。

非同源端接

必须强调的是,NHEJ没有强制性地引入插入和缺失;给出的Cas9 DSB(无损伤核苷酸钝的或接近平端)这样的产品是罕见的,大概占修复事件的小于5%的端部结构。然而,准确修复的产品很容易重新切割,同时插入缺失的产品都没有,如此反复循环,将有利于后期产品的积累。如上所述,切割和准确修复的单个周期时间应少于一小时,从而细胞组成型表达的靶向Cas9的群体应在一天内的大多数其染色体的具有插入缺失。预期冲击修理的另一个因素是,Cas9蛋白不立即从裂解后的断裂端,其可以与喾的装载和正常活动NHEJ干扰释放。

规范Cas9方法的变体也可以使用NHEJ。一对CRISPR引导的侧边区域有数百个或更多的碱基对,可以同时引入一对染色体断裂,并可能导致中间DNA的缺失(“弹出式”缺失),如果NHEJ连接到一起。同样,在Cas9靶向断裂(或成对断裂)时,通过nhej依赖修复(“popin”插入)也可以直接插入外源DNA片段含兼容出挑模板可用。Cas9也可以被改变以产生靶向的单链断裂;当两个这样的断裂在相反的链中相互靠近时,我们推测这将导致一个具有长悬垂的DSB。这种“双nickase”策略极大地减少了突变和脱靶位点的突变,但还不清楚NHEJ如何参与这类突变。


感谢我们的博客嘉宾!


David_Wyatt-guest_blog

大卫·怀亚特是一名研究生感兴趣的是确定如何断头影响结构他们如何修理。他在戴尔的实验室。

Dale_Ramsden-guest_blog

戴尔拉姆斯登是北卡罗来纳大学教堂山分校生物化学和生物物理学系以及莱恩伯格综合癌症中心遗传学和分子生物学课程的成员。

链接:

Addgene CRISPR指南:http://www.addgene.org/crispr/guide/

找到CRISPR质粒:http://www.addgene.org/crispr/

一般NHEJ参考文献:

限制染色体的断裂持续减少它的致突变性。Bennardo,N.,耿氏,A.,程,A.,仓促,P.,&斯塔克,J. M.公共科学图书馆遗传学,5(10),e1000683(2009)。考研。

非同源末端连接一个真正的本质易出错的过程?Betermier, M., Bertrand, P., & Lopez, b.s。公共科学图书馆,10(1),e1004086。(2014)。考研。

结扎步骤的保真度决定了在非同源端连接时末端如何被解决。水域,C. A.,Strande的,N. T.,普赖尔,J.M.,斯特罗姆,C.N。,Mieczkowski,P.,伯克哈尔特,M.D。,等人。自然通讯,5,4286。(2014)。考研。

CRISPR相关的参考文献:

在人类细胞中的染色体易位通过非同源规范最终接合产生。Ghezraoui H., Piganeau M., Renouf B., Renaud J.-B.。, Sallmyr, A., Ruis, B.等。分子细胞,55(6),829-842。(2014)。考研。

rna引导的CRISPR Cas9双切口增强基因组编辑特异性。冉,F. A.,许,P. D.,林,C.-Y.,Gootenberg,J.S。,Konermann,S.,特维诺,A. E.,等人。细胞,154(6),1380 - 1389。(2013)。考研。



更多来自Addgene的CRISPR博客:

点击下载该质粒101电子书(第2版)金宝搏手机旗舰厅app登录

主题:CRISPR,CRISPR 101

点击这里订阅Addgene博客金宝搏188app下载
订阅

所有的话题

查看全部

最近的帖子