CRISPR 101:RNA编辑CAS13

张贴了玛丽传动在7月31日,2020年8:30:00


最初发布于2017年11月30日,并更新了2012年7月31日。

CAS13酶迅速成为CrispRP领域的主要球员。冯张的实验室才刚刚迈出了一年Cas13a (C2c2)(Abudayyeh等,2016)作为RNA靶向CRISPR酶,它们适用于CAS13B,用于精确RNA编辑(Cox等,2017)。这种新的系统称为修复(用于可编程A至I(g)替换的RNA编辑)是第一个用于RNA编辑的CRISPR工具。两年后,实验室在RNA编辑器上发布了一篇论文,允许C到U编辑(救援)。我们将通过在您的研究中开发和潜在的方式进行这些工具的方式。

RNA编辑优势

RNA编辑对更传统的DNA编辑系统具有多种优点;首先,RNA编辑不需要homology-directed修复(HDR)机器,因此可以用于非分裂细胞。Cas13酶在目标位点也不需要PAM序列,这使得它们比Cas9/Cpf1更灵活。一些Cas13酶更喜欢特定的单碱基原间隔区侧翼位点(PFS)序列,但LwaCas13a等同源酶不需要特定的PFS。Cas13酶不包含负责DNA裂解的RuvC和HNH结构域,因此它们不能直接编辑基因组。基于cas13的RNA编辑系统可能是可逆的,并可以避免基因组脱靶或引入indels非同源终端连接(NHEJ)

设计RNA编辑器

张实验设想了一个双组分RNA编辑器:Cas13酶与RNA腺苷脱氨酶(ADAR)融合。这种系统会将腺嘌呤转化为Inoosine,翻译机械像鸟嘌呤一样。该RNA编辑器将允许RNA中的点突变,其可以重新承载或拯救已知的致病等位基因,或引入过早的止芯密码子以使RNA不官能。

为了建立一个强大的RNA编辑器,实验室从Cas13支架开始,测试了多达21个Cas13a同源物、15个Cas13b同源物和7个Cas13c同源物。他们希望找到一种稳定折叠的同源物,它可以稳定地剪切RNA,而不像LwaCas13a, LwaCas13a必须通过单体超折叠的GFP来稳定,平均只有50%的RNA敲低。在最初的测试中,Cas13b来自PREVOTELLA SEP。P5-125 (PspCas13b)平均下调62.9%,他们选择该酶进行进一步研究。PspCas13b不需要PFS,它对30 nt目标序列的12-26碱基的目标RNA不匹配敏感。

对于蛋白质的编辑部分,他们检测了ADAR1和ADAR2,它们在RNA中将腺苷脱氨成肌苷,产生了功能性的a - >g变化。他们将ADAR脱氨酶结构域(ADARDD)融合到dPspCas13b,但观察到低RNA编辑。为了增加A- >g编辑,他们使用了超活跃的ADAR结构,如ADAR2DD(E488Q)。他们还通过引入与目标a相反的C来调整引导RNA的结构。这种变化指定了gRNA间隔区存在多个a时进行的编辑,因为如果模板在该位置有胞嘧啶错配,ADAR将优先编辑腺嘌呤。

RNA编辑的示意图。GRNA和DCAS13B-ADAR2DD(E488Q)复合物在一起并结合靶RNA。然后它使A在GRNA中的错配C位点进行转换。我被翻译机构视为一个g

PSPCAS13B-ADAR2DD(E488Q)显示出具有30-84个核苷酸的各种间隔长度的鲁棒编辑,并指定该系统修复方法。使用下一代测序,他们确认了一个 - > i编辑,发现50个NT间隔物增加编辑效率,但也增加了目标窗口内的偏离目标编辑,可能是由于长度的双工RNA延伸。使用ADAR2DD催化突变体,它们表明编辑由ADAR2DD介导,而不是PSPCA13b。

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测试和改进Cas13b REPAIR系统的RNA编辑

为了测试修复程序的稳健性,实验室靶向34个致病性g->来自Clinvar数据库的突变。它们在HEK293T细胞中成功编辑了33/34个站点,最多在HEK293T细胞中编辑效率为28%,如使用RNA-SEQ评估。由于维修机械太大而无法适合腺相关病毒载体,因此他们测试了截断的老人德,看看它们是否可以缩小结构。它们鉴定了ADAR2DD(Delta984-1090),其降低了从4,473bp到4,152bp的修复程序结构大小而不降低编辑效率。

虽然ReparyV1击倒比ShRNA敲低更精确,但它仍然显示出实质性的偏离目标活动。通过突变与双相RNA相互作用的ADAR2中的残基,希望使ADAR-RNA结合稳定,以降低偏离靶标。测试构建体,ADAR2DD(E488Q / T375G)(REPAIRv2)具有最高的目标效率和最低的偏离目标编辑。在一个直接的转录组上宽的比较中,RepainV2从ReadyV1观察到的18,385减少了偏离目标位点,仅为20。

通过救援扩展RNA编辑能力

两年后,张实验室扩展了RNA编辑工具包,以允许使用它们的编辑救援 (RNA.E针对特定的C-to-U交换机)系统(Abudayyeh等,2019)。为了避免一些天然胞嘧啶脱氨酶RNA编辑的固有缺陷,他们进化了腺嘌呤脱氨酶ADAR2DD来脱胞嘧啶,并使用dRanCas13b(催化活性Cas13)来靶向胞嘧啶脱氨酶。对与RNA底物接触的ADAR2DD残基进行三轮合理的诱变,得到15%的C-to-U编辑活性。然后,他们在整个ADAR2DD中进行了16轮定向进化,以进一步优化胞苷脱氨酶活性。当RESCUE可以执行C-to-U编辑时,作者注意到它保留了腺嘌呤脱氨酶的能力。

然后,作者测试了RESCUE系统编辑内源性转录本的能力,发现编辑效率高达42%。他们注意到,在30新台币的指南中,当C或U型基础翻转出现在目标基地对面时,RESCUE是最活跃的。然而,他们发现除了靶向的C-to-U编辑外,RESCUE在靶向核苷酸周围有A-to-I脱靶编辑。在这些脱靶编辑的对面,指南中引入鸟嘌呤不匹配有助于减少RESCUE的局部脱靶编辑。为了解决全转录组rna测序中观察到的C-to-U和a - To - i转录组范围内的脱靶效应,作者进行了理性突变,并发现了RESCUE中的一个S375A突变(命名为rescue-s)在与救援相比,将〜45%和偏离目标A-to-i odies减少〜45%和偏离目标A-to-I的偏离目标C-TO-U编辑的约76%。

提交潜在使用救援在治疗应用中,作者测试了各种Drancas13B截短,这将允许包装用于病毒递送的构建体。他们发现C末端截短允许在足够小的救援系统中的相同或改进的编辑能力,足以用于病毒递送。

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未来的发展方向

在以前的RNA上瞄准与CAS13的RNA,修复是第一个基于CRISPR的系统,以实现精确的RNA编辑。添加救援进一步扩展了可以编辑的RNA编辑工具包和序列。如上所述,编辑RNA的能力具有多种优点,包括可逆性和在非分割细胞中使用。通过使用两个系统的扩展靶向能力,作者期待扩展使用RNA编辑在研究中及其潜在的治疗用途

我们也很好奇REPAIR和RESCUE是否能以多路复用的方式来编辑多个rna。很明显,CRISPR RNA编辑器将为科学研究打开新的大门——你将如何在你的研究中使用这些系统?


Cary Valley有助于更新本文。

参考

Cox, David B.T,等人,“用CRISPR-Cas13编辑RNA。”188棋牌游戏(2017):PII:EAAQ0180。PMID: 29070703

Abudayyeh, Omar O等,“靶向CRISPR-Cas13的RNA”。自然550(7675)(2017):280-284。PMID: 28976959

Abudayyeh,Omar O.等人。“C2C2是单组分可编程RNA引导的RNA靶向CRISPR效应器。”188棋牌游戏353(6299)(2016年):AAF5573。PubMedPMID:27256883。公共医学中心PMCID:PMC5127784

East-Seletsky,Alexandra,等。“CRISPR-C2C2的两个不同的RNA酶活性使能导向RNA处理和RNA检测。”自然538(7624)(2016):270-273。PubMedPMID:27669025

Gootenberg, Jonathan S.等。“CRISPR-Cas13a/C2c2核酸检测。”188棋牌游戏(2017): eaam9321。PubMedPMID:28408723。公共医学中心PMCID: PMC5526198

East-Seletsky,Alexandra,等。“通过功能性正交型VI-A CRISP-CAS酶靶向RNA。”Mol细胞。66(3)(2017):373-83。PubMedPMID: 28475872

Abudayyeh,Gootenberg等。“一种可编程单基RNA编辑的胞嘧啶脱氨酶。”188棋牌游戏2019年7月26日; 365(6451):382-386。PubMedPMID: 31296651

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