CRISPR 101:与Cas13a(C2C2)靶向RNA

发布者乔尔·麦克达德在2017年9月21日上午10时07分21秒


这个职位是更新了2020年7月27日。

CRISPR,具体地从Cas9化脓性链球菌(SpCas9),确实是一个特殊的基因工程工具。这是很容易使用,多数品种的功能,并有许多应用程序(见的CRISPR申请审查这里)。这就是说,SpCas9是不是在镇上唯一的游戏,其他CA蛋白喜欢SaCas9Cpf1可以规避与SpCas9相关的限制Cas13a(以前称为C2C2),具有若干独特的特性在于进一步扩大CRISPR工具箱。我们将介绍Cas13a是如何确定的,Cas13a的结构和功能,重点是什么使这个分子独特的,Cas13a的各种应用。

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裂解CRISPR核酸一种RNA:Cas13a的起源

Cas13a是最初在2015年确定(Shmakov等人,2015)。他们用CAS1,通常与CRISPR阵列相关联,并且参与间隔采集感染后,作为“诱饵”的一种形式到细菌基因组内识别新CRISPR相关蛋白的基因。从这个分析中,他们确定53个潜在的候选基因,基于CRISPR蛋白的所讨论的架构落入3类:C2C1,C2C2和C2C3(短为2级,候选1,2或3)。C2C1和C2C3都跟Cpf1,但它们需要既tracrRNA和crRNA切割靶DNA(Cpf1仅需要一个用于crRNA目标识别和切割)。C2C2(现在被称为Cas13a)在结构和功能方面的独特,因此将成为该博客文章的其余部分的焦点。

也许Cas13a和Cas9之间最大的区别在于Cas13a结合和裂解RNA而不是DNA底物。在结构方面,Cas13a股无同源性的最常用的酶CRISPR - Cas13a包含两个结构域HEPN,而Cas9使用HNH和RuvC域切割靶DNA。内Cas13a的HEPN域是RNA切割,与其他蛋白HEPN领域知名的角色是一致至关重要。与Cas9,变异在Cas13a分子结果的关键残基在“核酸死” Cas13a(dCas13a),即能够结合靶RNA,但缺乏以切割RNA靶的能力。

表1:比较常见的上CRISPR酶

名称 酶结构域 指南RNA 目标 PAM(PFS) 切割机制
Cas9 HNH,RuvC

TracrRNA,crRNA

脱氧核糖核酸

5' NGG

特定平端DSB在靶DNA

Cpf1

RuvC样

crRNA 脱氧核糖核酸 5' TTN 在靶DNA特异性DSB具有5' 突出端
Cas13a(C2C2) 2X HEPN crRNA RNA

3' A,U,或C(不是必需的所有直系同源物)

特异性RNA裂解(随后在细菌非特异性RNA酶活性)

Cas13a用单crRNA目标

张枫实验室用过的从Cas13a纤毛shahii(LshCas13a)开始表征这种新的效应(Abudayyeh等,2016)。内源性CRISPR / Cas9系统,Cas9既使用tracrRNA和crRNA便于分别结合和靶DNA的切割。LshCas13a,另一方面,只使用短〜24个碱基crRNA与所述Cas13a分子通过丰富尿嘧啶茎环和交互功能有助于靶结合和切割通过一系列的Cas13a分子中的构象变化。像Cas9,Cas13a容忍的crRNA和靶序列之间的错配的单,当2个错配存在Cas13a的切削但是效率降低。所述protospacer侧翼序列(PFS),用于LshCas13a,这是类似于PAM序列对于Cas9,位于间隔序列的3’ 端和由一个单一的A,U或C碱基对。

在细菌中,一旦Cas13a已经认识到和由crRNA序列指定的切割其靶RNA序列,它采用酶促“活动”状态,而不是恢复到像Cas9或Cpf1非活动状态。其结果是,将Cas13a然后结合和切割附加RNA的无论同源性的crRNA或PFS的存在。与此形成鲜明对比的Cas9,这要求每个DNA靶具有高序列同一性的间隔序列和包含相应的PAM顺序。非特异性切割被认为是激活程序性细胞死亡或休眠状态为已经感染了噬菌体来限制整个人口感染的传播细菌细胞。Cas13a的这种特性开辟了使用Cas13a作为诊断工具,如下面所讨论的可能性。

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Cas13a的应用

步骤使用Cas13作为诊断工具。核酸被第一放大或转录成RNA。如果Cas13蛋白裂解一个RNA片段,作为导演由cRNA的,它将开始切割任何和所有的RNA,包括荧光RNA记者。

什么是Cas13a的潜在应用给予了我们知道它的结构和功能?对于初学者来说,Cas13a可用于结合和切割靶RNA,虽然其在细菌细胞中有用性将可能通过Cas13a的倾向结合和切割RNA非特异性的限制。dCas13a的结合靶RNA而无需裂解分子(如dCas9)的能力表明dCas13a可以是用于从一个群中分离特定RNA序列(富集或消耗特定RNA出来的RNA池的)或在活研究RNA加工有用细胞。事实上,组已经利用dCas13融合蛋白用于成像,跟踪,调制剪接,和调节特异性靶向的RNA的表达。

最后(也许是最有趣的),Cas13a的倾向,结合用户定义的RNA序列可能是切割后的RNA任何用于检测与高特异性的RNA种类的单个分子(Gootenberg等人,2017)。这个系统,被称为福尔摩斯(图1中示出)已被用来寨卡病毒,基因型的人DNA的分化菌株,确定无细胞的基因组DNA内的肿瘤突变,并检测COVID-19(祯,Ladha等人,2020)。

Cas13a在哺乳动物细胞

张实验室取得了令人振奋的发现,一些在哺乳动物和植物细胞Cas13a同源物可以起到(Abudayyeh等人,2017)。他们特征Cas13a从纤毛wadei(LwaCas13a),使用超折叠GFP融合,以稳定在哺乳动物细胞中的蛋白质。LwaCas13a-msfGFP可以调解与切割长度从20-28个核苷酸间隔,并且不需要特定的PFS,使其成为一个非常灵活的系统裂解。LwaCas13a是也适用于复用;表达5个gRNAs同时产生可比的基因敲除单gRNA表达。

虽然抵押品RNA裂解反应是在细菌细胞中很好地描述,LwaCas13a不显示在真核细胞的非特异性RNA切割活性的。他们通过全球RNA表达,细胞应激和RNA大小分布的分析,得出这个结论。当比较LwaCas13a到shRNA的,他们发现LwaCas13a显示类似击倒效率,但没有显著脱靶效应,一个鲜明的对比,数百观察的shRNA脱靶。它们随后使用催化失活dLwaCas13a作为可编程RNA结合蛋白,用于体内RNA成像创建荧光融合蛋白dLwaCas13a-NF。

总之,Cas13a分子带来了多样性的CRISPR工具箱一个备受期待的元素,将继续扩大CRISPR的应用。由于这篇文章最初发表,我们也看到Cas13b的新发展作为一种工具RNA碱基编辑,,我们很高兴地看到这组酶继续在该领域的CRISPR飞溅。我们认为的CRISPR社区内共享的文化是快速的技术发展领域看到的重要组成部分和往常一样,我们体味到与科学界分享这些宝贵的试剂的机会。


注:卡里谷和玛丽杠杆促进了这篇文章的更新。

参考

1. Abudayyeh,奥马O.,等人。“C2C2是单组分可编程RNA引导的RNA靶向CRISPR效应”。188棋牌游戏353(6299)(2016):aaf5573。考研结论:27256883。PubMed中心PMCID:PMC5127784

2.东Seletsky,亚历山大,等。“CRISPR-C2C2的两个不同的RNA酶活动使导RNA加工和RNA检测。”性质538(7624)(2016):270-273。考研结论:27669025

3. Gootenberg,乔纳森S.,等人。“核酸检测用CRISPR-Cas13a / C2C2”。188棋牌游戏(2017):eaam9321。考研结论:28408723。PubMed中心PMCID:PMC5526198

4。东Seletsky,亚历山德拉等。“RNA靶向由功能正交型VI-A CRISPR-CAS酶”。分子细胞。66(3)(2017):373-83。考研结论:28475872

5。Abudayyeh,奥马尔O.,等人。“RNA与CRISPR-Cas13目标。”性质550(7675)(2017):280-284。结论:28976959

6。Shmakov,塞吉,等。“发现多样类2的功能表征CRISPR-CAS系统”。分子细胞60.3(2015):385-397。考研结论:26593719。PubMed中心PMCID:PMC4660269

7. JOUNGĴ,Ladha A,等人,“床边血糖检测COVID-19使用SHERLOCK诊断”。medRxiv2020可8.考研结论:32511521。PubMed中心PMCID:PMC7273289

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