金宝搏手机旗舰厅app登录质粒101:复制起点

发布者肯德尔摩根在2020年11月11日上午09点23分38秒


最初发表2014年2月6日和最后更新二○二○年十一月一十日。

现在我们知道所有关于抗生素抗性基因,让我们考虑另一个任何质粒的基本元件:复制/复制的起源。该复制由复制的原点(ORI)和它的所有控制元件。该ORI是其中DNA复制的开始,使质粒复制本身,因为它必须对细胞内生存的地方。

质粒的复制通常是从用于复制宿主的染色体DNA的那些不同,但他们仍然依赖于宿主机器进行额外的副本。ORI序列是在A和T通常较高。你为什么问?那么,A-T碱基对与两个氢键不是三个如G-C对保持在一起。其结果是,在A-T对富含DNA的段可以更容易地在较低温度下分离,并允许复制机械室进来和忙碌复印。

复制起点的类型

有很多的复制起点在那里的话,为了简单起见,我们忽略了那些在真核细胞和病毒的使用,只集中在那些发现细菌。你可能会看到一些常见的包括ColE1,pMB1(这是在一个少数略有不同,但众所周知的衍生品),pSC101,R6K和15A。没有复制的所有来源都是一样的。有些人会产生许多拷贝质粒和其他取决于它们是如何调控产生短短副本。通常,复制控制被称为“松弛”或“严格“这取决于是否ORI通过分别RNA或蛋白质,正调节。质粒的拷贝数有积极和消极监管之间的平衡做的,可以在复制的突变被操纵。例如,pMB1ORI维持大约每个细胞20个拷贝,而pUC的-其不同点仅由两个突变-将生产每单元多达700份。

质粒图谱示出了与插入的基因周围多克隆位点选择性标记和抗生素抗性基因以及所述ORI,启动子,和插入的基因
图1:质粒图谱示出了质粒的标准功能。

那么,你如何选择?Addgene公司资深科学家帕特里克·马西说,研究人员可以问自己几个问题开始:

  • 将质粒独占使用大肠杆菌?在一般的革兰氏阴性菌?革兰氏阴性和革兰氏阳性?
  • 你会在某一时刻在你的细胞中只有一个质粒类型?
  • 你想使你的很多质粒的?
  • 是基因毒性含量很高?这是一件好事到kEEP记住,使用低到中等拷贝数质粒仍然可以表达蛋白的大量给予适当的启动和生长条件。

选择你的复制起点明智地避免质粒不兼容

换句话说,最好的选择ORI取决于你要多少份质粒维护,你想哪个主机或主机来使用,以及是否不需要考虑与一个或多个其他质粒您质粒的兼容性。一般来说,用相同的质粒ORI不兼容因为他们将争夺相同的机械,创造了一个不稳定和不可预测的环境。作为一项规则,从同一组中的质粒不应该是共转化,因此,如果您需要两个质粒的实验,确保他们有“兼容”ORI”秒。请参阅下表以了解详情。

通用矢量 拷贝数+ ORI 集团不兼容 控制
pUC的 〜500-700 pMB1(衍生物) 一种 轻松
的pBR322 〜15-20 pMB1 一种 轻松
宠物 〜15-20 的pBR322 一种 轻松
的pGEX 〜15-20 的pBR322 一种 轻松
pColE1 〜15-20 ColE1 一种 轻松
pR6K 〜15-20 R6K * C 严格
的pACYC 〜10 P15A 轻松
pSC101 〜5 pSC101 C 严格
的pBluescript 〜300-500 ColE1(衍生物)和F1 ** 一种 轻松
的pGEM 〜300-500 的pUC和F1 ** 一种 轻松

此表定义了通用的克隆载体,其拷贝数,ORI和不相容组。注意在A -C兼容性分组是任意指定,并从相同的不相容性群的质粒不应该是共转化。

+实际拷贝数变化。请参见下面的其他注意事项。

*需要复制PIR基因(参考)。

** F1是噬菌体衍生的ORI允许复制和ssDNA的包装到噬菌体颗粒中。噬菌体衍生的质粒ORI”小号被称为噬菌

影响质粒拷贝数等因素的影响

虽然在顺序和调控ORI显着影响的质粒的拷贝数,其他外部因素造成,以及。这些因素是要记住,如果你打算净化您的质粒DNA特别有用:

插入

  • 细菌倾向于保持质粒较少的副本,如果它们含有大量插入时会产生有毒产物的基因。

大肠杆菌应变

  • 大肠杆菌可用于繁殖质粒,但endA-大肠杆菌是最好的质粒的高收益。

生长条件

  • 曝气,温度,培养物体积,抗生素,和介质的量都可以影响拷贝数。一些ORI的是温度敏感的;其他ORI的可以‘骗’在加入氯霉素的放大更多副本-确保你的生长条件不工作对你!

文化接种

  • 新鲜划线的细菌有较高的拷贝数-以获得最佳效果总是挑单菌落并不会直接从甘油原种,琼脂刺,或液体培养物传代培养。
  • 新鲜的转化细胞也给予了较高的质粒产率,从甘油原液划线菌落。
  • 培养12-16小时,往往给予较高的拷贝数,因为细菌刚刚达到稳定期,但这些细胞还没有开始死光。

有什么问题吗?需要什么澄清?如果是的话请发表在评论中。此外,让我们知道,如果你有关注下一批未来的质粒101系列的主题和住宿任何特殊要求。金宝搏手机旗舰厅app登录

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