CRISPR 101:胞嘧啶和腺嘌呤碱基编辑

发布者玛丽传动装置2020年8月6日上午10:30


最初发表2016年8月16日和最后更新2020年8月6日。

当我们谈到CRISPR应用程序时,经常会出现一个负面的问题:低编辑效率homology-directed修复(HDR)。相比非同源末端连接,HDR发生在相对低的频率,并且在非分裂细胞,该途径被进一步下调。而不是试图改善HDR,科学家已经开发出两类基地编辑:胞嘧啶碱基编辑器(CBE的)和腺嘌呤碱基编辑器(ABES)。

(也有RNA碱基编辑器,但我们只会在这里介绍DNA碱基编辑器。要了解更多关于RNA碱基的信息,请点击这篇博客:CRISPR 101:RNA编辑与Cas13)

什么基地能立足编辑编辑?

CBEs介导C到T的变化(或G到相反链上的变化)。ABEs使A到G发生变化(或者在相反的链上T到C发生变化)。这只是12种可能的变化中的4种。

最近,的发展主要编辑,它使用比的CBE或ABES不同的机制,从大卫刘的实验室使得科学家能够实现所有12种可能的碱基对碱基的改变。

如何做基础工作的编辑?

基本的编辑需要三个要素。宽广地:

  1. 在CAS切口酶或CAS融合到脱氨酶,使编辑
  2. 一个gRNA针对中科院的特定基因座
  3. 目标基站用于由CAS蛋白指定的编辑窗口中编辑

这些元件分别朝向第一胞嘧啶碱基编辑从博士后亚历Komor以及从所述第一腺嘌呤碱基编辑发展的起点妮可Gaudelli2016年在David Liu的实验室。

胞嘧啶基地编辑

胞嘧啶碱基编辑的开端

Komor创建第一个胞嘧啶碱基编辑器通过偶合胞苷脱氨酶与非活动dCas9(Komor等人,2016)。这些融合胞嘧啶转化成尿嘧啶无需切割DNA。尿嘧啶然后随后通过DNA复制或修复转换成胸腺嘧啶。熔合的尿嘧啶DNA糖基(UGI)到dCas9抑制剂防止碱基切除修复,其改变在U回C突变。为了提高基地的编辑效率,你需要一种方法来迫使细胞使用脱氨的DNA链作为模板。要做到这一点,用于实验室在CAS切口酶,而不是dCas9。将得到的编辑,BE3,刻痕未修饰的DNA链,以便它显示“新合成的”到电池中。因此,细胞修复使用该含U型链作为模板的DNA,复制基编辑。

原理胞嘧啶碱基的编辑。gRNA和Cas9-胞苷脱氨酶融合聚集在一起,并形成一个复杂和结合靶。胞苷脱氨打开了自由链上的C至U形。错配修复蜜饯编辑,修饰链作为模板。
胞苷脱氨作用发生在DNA的自由链地方和C向U转变而不会产生双链断裂。

BE3系统将人类细胞系中多种靶标的编辑频率提高到30%以上,平均indel频率仅为1.1%。对于检测的基因座来说,这些数字是cas9介导的HDR的巨大改善,其中HDR介导的平均编辑频率仅为0.5%,并且观察到更多的indel而不是点修饰。CRISPR基编辑通过多次细胞分裂持续存在,表明此方法产生稳定的编辑。然而,本系统也存在基于Cas9脱靶活动的脱靶编辑。

点击这里找到CRISPR碱基编辑质粒

提高胞嘧啶碱基编辑范围和效率

由于BE3的发展,许多研究小组已经做了改进,基础编辑,包括:

  • 扩大瞄准仪
  • 提高编辑的效率
  • 减少非目标效应

在2016年,近藤昭彦的实验室创建目标-AID基本编辑器使用从海七鳃鳗胞苷脱氨酶融合到Cas9切口酶(Nishida等人,2016)。目标-AID执行类似但不相同于BE3,修改3-5基本窗口的PAM的18个碱基上游。

David Liu的实验室用其他脱氨酶生成了BE3变种:AID、CDA1和APOBEC3G (Komor等,2017)。CDA1-BE3和AID-BE3编辑铯比BE3更有效地以下一G,但APOBEC3G显示较难预测序列偏好。

刘实验室还使用了天然和工程Cas9变种来开发具有不同PAM序列的五个新的碱基编辑器,扩大基编辑可用目标位点的数目(Kim等人,2017)。对于每个基本编辑器,他们观察到编辑活动具有〜50%的最小效率,并证实该融合蛋白保留了个体Cas9的PAM性能。他们还诱变的基本编辑器的胞苷脱氨酶部分与编辑窗口小如1-2个核苷酸创造SpCas9基地的编辑。

为了减少脱靶用碱编辑,实验室Rees等相关联的效果。创建HF-BE3,含有碱编辑高保真Cas9变种HF-Cas9(Rees等人,2017)。HF-BE3显示37倍以下的脱靶编辑比BE3,只有在基于目标的编辑效率会有所降低。为了进一步提高特异性,他们纯化HF-BE3蛋白用于递送在核糖核蛋白颗粒(的RNP)同时斑马鱼胚胎和小鼠内耳。

第四代的基础编辑

第四代基编辑,BE4,减少不希望的C-> G或C->可与BE3的发生甲转换。Ť这些副产物可能是由尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)碱基切除修复期间从切除造成的。加入UNG抑制剂,UGI,的第二个拷贝增加碱编辑产品的纯度。该实验室还延长了APOBEC1-Cas9n和Cas9n-UGI接头,以提高产品纯度,而这三个改进表示第四代基的编辑。相比BE3,BE4提供在C-> G和C- 2.3倍的降低>一种产品以及在INDEL形成2.3倍的降低。

为了进一步降低插入缺失形成的1.5-2倍,团队融合蛋白噬菌体去BE4的n端(Komor等人,2017)。GAM结合双链断裂的自由端,这可能会导致细胞死亡,而不是NHEJ修复,从而去除从所述编辑的人口这些细胞。

另一种提高哺乳动物碱基编辑效率的方法是确保编辑器进入细胞核并得到良好的表达。刘实验室修改了BE4的核定位信号和密码子使用创造BE4max和AncBE4max编辑效率提高了4.2-6倍(Koblan等人,2018年)。

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腺嘌呤基编辑

腺嘌呤碱基编辑的开始

David LIu实验室的Nicole Gaudelli创造了一个腺嘌呤碱基编辑器转换腺嘌呤到肌苷,从而导致A至G的变化(Gaudelli等,2017)。创建一个腺嘌呤基编辑器需要一个额外的步骤,因为没有已知的DNA腺嘌呤脱氨酶。他们利用定向进化从RNA腺嘌呤脱氨酶TadA中创造了一个。

后七轮分子进化,他们获得的四个腺嘌呤碱基编辑器(ABES)。ABE7.10是最活跃的编辑器中,显示了53%的平均编辑效率与目标位置4-7的编辑窗口。ABES 6.3,7.8,和7.9显示稍宽编辑的4-9位置的窗口,虽然编辑的效率可以是在位置8和9下虽然胞嘧啶碱基编辑器通常产生编辑的混合群体,ABES不显示显著A到非在靶基因座-G转换。肌苷从DNA除去可能不频繁,因此防止碱基切除修复的诱导。

在脱靶效应而言,ABES也媲美其他方法。在头部与Cas9头比较,Cas9改性9/12用14%INDEL率已知的脱靶,而ABE7.10改性仅4/12脱靶以1.2%的频率。虽然实验室没有进行ABE特异性的全面全基因组的研究,他们的其他实验表明,ABES是稳健的,但具体的编辑器。

提高腺嘌呤碱基编辑

Liu实验室在创建上述BE4max和AncBE4max时,也制作了腺嘌呤碱基编辑器,改进了核定位和表达。这个基本编辑器被命名ABEmax

在2020年,发表了两篇文章,描述了从ABE7.10进化而来的附加ABEs,这些ABEs改进了基本编辑器的定位灵活性和特异性。在这第一次,Liu实验室使用噬菌体辅助进化选择系统来生成ABE8e(TADA-8E V106W),这编辑~590倍比来自ABE7.10的TadA快不增加偏离目标的活动(Richter et al., 2020)。这很重要,因为ABES一般都慢这意味着Cas9结构域通常会在DNA被编辑之前释放。

Gaudelli使用ABE7.10作为起点发展基础编辑成40个新变种ABE8(Gaudelli et al., 2020)。ABE7.10相比,ABE8s与ABE7.10相比,NGG PAM中原起子位置A5-A7的编辑量增加了1.5倍,A3-A4和A8-A10的编辑量增加了3.2倍,非NGG PAM变体的编辑效率提高了4.2倍。ABE8s具有改进的基本编辑能力,即使是在以前难以定位的站点上也是如此。ABE8s可在原代T细胞中实现98-99%的靶修饰,使之成为a细胞治疗应用前途的工具

双基地编辑

什么都编辑的功能组合成一个?这最近已通过融合腺嘌呤和胞嘧啶编辑组件一起完成的。

Keith Joung的实验室创造了一个双脱氨酶编辑器,叫做空间(同步可编程腺嘌呤和胞嘧啶编辑器)融合miniABEmax-V82G和目标辅助到Cas9(Grunewald et al., 2020)。另一个实验室采用了类似的方法。李大理实验室的A&C-BEmax由a组成胞苷和腺苷脱氨酶的融合与Cas9 nickase (Zhang等,2020)。与ABEmax相比,它提高了CBE活性,降低了RNA离靶活性。

基本编辑出版亮点

出版物 质粒 突出了
Komor等人,2016 BE1、BE2 BE3 BE3显示编辑效率最高,但较高的插入缺失形成比BE2
Nishida等,2016 目标-AID 编辑PAM上游-18位置周围的3-5个基本窗口
Kim等人,2017年 SaBE3,BE3 PAM变种,BE3编辑窗口变种 大大扩展了基本编辑的目标轨迹的数量
Rees等人,2017 HF-BE3 HF-BE3和核糖核酸蛋白的传递降低了BE3的脱靶活性
Komor等,2017 BE4和BE4-GAM;AID,CDA1和APOBEC3G BE3变种 第二份UGI提高了产品纯度。Gam降低indel频率。
Koblan等人,2018年 BE4max、ArcBe4max ABEmax 改进了核定位和表达
Gaudelli等人,2017年 腺嘌呤碱基编辑器(ABE7.10) A- >i (A->G)编辑,产品纯度高,脱靶率低
Richter等人,2020年 ABE8 590x更快腺嘌呤碱基编辑大于ABE7.10
Gaudelli等,2020年 ABE8e 高效编辑初级单元格
Zhang等,2020 A&C-BEmax 既有胞嘧啶和腺嘌呤碱基编辑
Grunewald等人,2020年 空间 既有胞嘧啶和腺嘌呤碱基编辑

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珍妮弗曾促成了更新这篇文章。

参考文献

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