滴滴你的慢病毒准备的提示

发布的梅根·“政府改造”2016年3月15日上午10:30:00



病毒效价blugene这一天已经到来;你精心呵护了你的包装细胞系,准备了你的DNA,转染并收获了你的慢病毒。现在是时候继续治疗你的感染并制造稳定的细胞系了。虽然我们都经历了推动项目向前发展的压力,但不应该匆忙进行转导。任何转导在开始之前,您应该效价病毒—也就是说,确定病毒的数量你有准备。花时间去适当的效价感染病毒不仅能确保你的设计以最好的方式,但它也可以节省你的时间。继续阅读,了解滴定选项的概述以及不同方法的优缺点(要了解这里讨论的所有方法的综合协议,请参阅
库特纳等人。)。

物理效价和功能效价

病毒滴度通常有两种,物理滴度和功能滴度。物理滴度测量样本中病毒颗粒的数量,通常基于病毒蛋白(如p24)或病毒核酸的存在。功能滴度,或感染滴度,测量产生的病毒颗粒有多少能真正感染细胞。这些检测通常包括用你的病毒感染目标细胞系,并检测转移质粒上的基因的表达,或量化整合到目标细胞基因组中的病毒拷贝的数量。

物理效价

包装和滴度慢病毒物理滴度的两个最常见的测定是通过ELISA和QPCR进行直接P24测量,用于病毒RNA。测量病毒准备中的P24水平是简单快捷的,因为有几种商用p24 ELISA试剂盒这可以在数小时内量化p24水平。然而,这种方法的一个主要缺点是,p24 ELISA检测样品中所有的p24,而不管它是否被纳入病毒颗粒中。因此,基于p24定量的滴度往往被高估,因为它们可能包括游离p24和缺陷病毒颗粒。

慢病毒RNA的直接测量是p24直接测量的一种替代方法。与p24 ELISA一样,这种方法相对快速,不到一天就能得到结果,但往往比ELISA试剂盒便宜。在这种方法中,病毒RNA首先转化为cDNA,然后使用针对特异性的qPCR引物进行定量病毒组件比如LTRs, gag, WPRE,抗生素抗性基因,或者转基因本身。许多研究人员倾向于设计针对病毒载体主干的共同特征的引物;一旦验证,这些通用引物可以用于滴度任何慢病毒准备,共享该特定特征。针对转基因的引物也有利于确保转染过程中正确使用转移质粒;如果同时制备几种不同的慢病毒,应考虑采用这种方法。

与p24实验相似,通过测量病毒RNA滴度可以过高估计准备中的传染性病毒的数量,因为测量将包括缺陷颗粒。研究发现,价值观可以高10 - 1000倍而不是依赖于载体主干的功能分析。当使用基于qPCR的病毒滴定方法时,考虑在单独的对照反应中使用逆转录酶突变体。这将使您可以量化来自原质粒扩增的PCR产物的数量,这可能会导致结果过度膨胀。一个逆转录酶缺失的包装载体将产生低水平的病毒,并可用于跟踪携带。

功能效价

量化感染细胞的数量功能效价被认为是一种更准确的方法来量化病毒,因为它只测量传染性病毒颗粒。最简单的方法之一测量功能效价使用流式细胞仪计数的数量目标向量编码的转基因细胞阳性表达与串行转导后稀释的病毒准备。这种方法特别有用当向量携带使用荧光标记,因为它不需要抗体染色。

请查看我们的荧光滴定深度协议

另一种流行的方法是利用抗生素抗性基因进行转移质粒。用一系列稀释的病毒制剂转导目标细胞,用抗生素处理,并定量化集落形成单位。虽然这些方法往往比测量物理滴度更准确,但也存在可能低估病毒滴度的风险,因为这些方法无法区分一个整合了一个病毒粒子的细胞和一个有多个整合事件的细胞。此外,启动子的选择也会影响转基因的表达。

最精确的慢病毒滴定方法是使用qPCR来测量整合到目标细胞基因组中的前病毒拷贝的数量。这种方法可以区分多重整合事件,减少低估病毒滴度的可能性。这种方法的主要缺点是它可能是相当劳动密集型的。目标细胞通过一系列稀释的病毒制剂、分离的基因组DNA转导,针对病毒成分或转基因本身的引物被用来量化整合事件的数量。这种方法的另一个缺点可能是缺少合适的控件。这种检测方法的最佳对照是已知含有qPCR靶基因1个完整拷贝的克隆细胞系。开发合适的控制系通常需要用有限的感染多样性(MOI)进行转导,以确保只有一个拷贝整合,通过抗生素耐药性选择或基于表面标记表达的单细胞分选、亚克隆、扩增和确认。这一过程可能需要几个月的时间,但应该考虑在实验室将常规产生病毒或需要精确滴度。

慢病毒滴度的其他注意事项

音量和转导时间会影响慢病毒滴度,靶细胞类型也会影响。因此,在比较不同批次的病毒时使用标准条件是至关重要的。此外,有些病毒制剂对冻融循环非常敏感;用新鲜收集的慢病毒制备物测得的效价可能显著高于在冰箱中保存的相同的制备物。如果您计划冻结一批病毒以长期使用,您可能需要考虑使用经过冻结/解冻循环的等分样品进行滴度,因为这将更好地代表未来的实验。

上述的滴度选择都有其优点和缺点。不常规生产病毒的实验室可能想要选择更直接的方法,如基于流式细胞仪(facs)或菌落形成单元分析,而常规生产病毒的实验室可能想要考虑更准确的前病毒整合分析。无论哪种情况,正确滴度你的病毒准备是一个成功的转导实验的关键的第一步。

点击这里下载病毒载体101电子书


参考

1.罗伯特·H·库特纳,张咸阳,雅各布·赖泽。伪hiv -1型慢病毒载体的生产、浓缩和滴定自然的协议4.4(2009): 495 - 505。PubMedPMID:19300443

2.Geraerts, Martine等。慢病毒载体滴定法的比较BMC生物技术6.1(2006): 1。PubMedPMID:16836756。公共医学中心PMCID:PMC1534021

3.张兵等。“慢病毒载体滴定和使用感染多样性(MOI)预测基因转移事件的控制条件的重要性。”基因疫苗和治疗2.1(2004):1。PUBMEDPMID:15291957。公共医学中心PMCID:PMC514534

Addgene博客上的其他资源金宝搏188app下载

更多资源请访问Addgene.org

主题:病毒载体,病毒载体协议和提示,逆转录病毒和慢病毒载体

点击这里订阅Addgene博客金宝搏188app下载
订阅

所有的话题

看到所有

最近的帖子