单分子水平上的可视化翻译

发布的玛丽传动装置2017年8月1日上午9:15:16


调节翻译是细胞功能的关键,特别是在发育或应激期间。通过核糖体分析,研究人员已经能够研究各种刺激对全局翻译的影响,但视觉技术研究翻译仍然是难以捉摸的。两种技术加入储层器通过两种不同的方式更容易跟踪翻译:通过监测第一轮翻译或通过长期跟踪单个mRNA的翻译。它们都在帮助研究人员探索细胞生理学中翻译控制的复杂性。

核糖体貌相

核糖体分析是2009年发展起来的一种生化方法,它对细胞中所有mRNA结合的核糖体进行“快照”。当细胞mRNA被核糖核酸酶消化时,核糖体保护它们所结合的mRNA片段。这些区域随后被测序,并与基因组对齐,以确定全基因组翻译频率。虽然这种技术非常有用,但它需要大量的样本处理以避免破坏核糖体- mrna复合体。最近的工作已经采用这种技术来监测局部翻译,并确定蛋白质是否靶向到他们的目的地共或翻译后。

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技巧:可视化第一轮翻译

而核糖体分析选择核糖体的物理位置,TRICK (T.ranslatingR.NA一世法师的C燕麦的蛋白质K.Nock-Off)而是利用核糖体的运动。当核糖体沿mRNA移动时,它使其他RNA结合蛋白质取代以允许翻译。对于诀窍报告者MRNA,这种位移导致荧光信号的变化:未转换的RNA出现黄色,并且翻译的RNA出现红色。要启用此颜色切换,技巧需要以下组件:

  1. 通过PP7涂层蛋白与报告MRNA的编码区域结合的GFP蛋白(NLS-PCP-GFP
  2. RFP蛋白通过MS2涂层蛋白与报告器mRNA的3'UTR结合(NLS-MS2-RFP
  3. 报告基因mRNA,包含荧光蛋白的系结位点,并由一个可诱导启动子(质粒)驱动188滚球与投注188金宝搏官网app6454264543

在翻译之前,GFP和RFP都绑定到记者,导致它出现黄色。翻译的行为推动mRNA的NLS-PCP-GFP,只留下与记者绑定的红色FP。因为它含有核定位信号,因此NLS-PCP-GFP然后返回核,以结合同源的未旋转MRNA。通过使用PP7和MS2涂层蛋白结合位点的多个副本来实现该系统的高特异性和分辨率,以将许多FP-CAT蛋白融合副本与他们的报告MRNA系列。使用翻译抑制剂环己酰亚胺和嘌呤霉素,Halstead et al。验证翻译对于从TRICK报告中删除GFP是必要的。

诀窍记者已知延迟翻译在开发中是重要的,并且Halstead等人。用法检查果蝇图案化基因的翻译奥斯卡。在发展的早期,osk-TRICK记者被贴上了双重标签,表明存在翻译抑制。在后期阶段,单一rfp标记欧斯克后极检测Oskar蛋白。Oskar蛋白水平与GFP强度呈负相关,表明TRICK是相对报告翻译的准确解读。

单分子连续翻译跟踪

技巧允许您看到第一轮的翻译,但它不允许继续跟踪给定的mRNA,因为通过翻译mRNA的第一核糖体去除NLS-PCP-GFP。允许跟踪时间,yan等人。设计了一种标记mrna和它们对应的新合成蛋白质的系统。在TRICK系统中,报告基因mRNA的3 ' UTR被PCP-mCherry标记(图2)。3 ' UTR还包含一个CAAX序列,用于将mRNA结合到质膜上;这个序列阻止了mCherry标记的mRNA的扩散,并将其保持在一个单一视野中,以便持续跟踪。然后你就可以直接监控这个mRNA的多轮转译;你可以看到单分子水平上的平移动力学。

Yan等人的编码序列。的记者含有24份SunTag,一种合成支架,可以募集到阳光特异性抗体SCFV融合的GFP。每次报告者被翻译时,新生多肽上的Suntag网站都会募集SCFV-GFP,产生与红色报告器mRNA结合的绿色斑点。yan等人。使用哈林顿胺,一种翻译抑制剂,其在引发后停止核糖体,计算核糖体的易位率为〜3.5密码子/秒。他们还探讨了5'UTR变体在细胞周期蛋白质EMI1翻译中的影响,显示〜80%的长5'UTR的转录物翻译沉默。

随着时间的推移跟踪翻译

这两种方法都会增加我们对翻译动态的理解,但它们带有一些警告。在这两种情况下,创建报告器mRNA需要将多个发夹序列插入编码序列和3'UTR中。在开始实验之前,重要的是验证这些变化不会影响翻译率,因为这些论文的作者做了。由于基于SunTag的系统将MRNA的MRTHAs与质膜结合起来,因此不适合使用通常在特定隔室中翻译的MRNA使用。尽管有这些限制,但这些技术代表了在各种细胞类型和生理状态中研究翻译的强大工具。


参考文献

1.Ingolia, Nicholas T.,等人,“使用核糖体分析的核苷酸解析翻译的体内全基因组分析。”188棋牌游戏324(5924)(2009): 218 - 23所示。PMID:19213877PMCID: PMC2746483

2. Halstead,James M.等人。“翻译。用于将第一轮翻译对单细胞的RNA生物传感器对活体动物进行成像。“188棋牌游戏347(6228)(2015):1367-71。PMID:25792328PMCID: PMC4451088

3.燕,Xiaowei,等。“体内单mRNA分子翻译的动态。”细胞165(4)(2016):976-89。PMID:27153498.PMCID:PMC4889334

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